Los plásmidos (que se muestran aquí con varios genes resaltados en una micrografía electrónica de transmisión en color) son estructuras circulares de ADN utilizadas en los laboratorios de biología.Crédito: Dr. Gopal Murthy/Spl
Los plásmidos fabricados en laboratorio, el caballo de batalla de la biología moderna, tienen problemas. Los investigadores llevaron a cabo una evaluación sistemática de construcciones circulares de ADN analizando más de 2.500 plásmidos producidos en laboratorios y enviados a una empresa que brinda servicios como empaquetar las construcciones dentro de virus para que puedan usarse como terapias genéticas. El equipo descubrió que aproximadamente la mitad de los plásmidos tenían defectos de diseño, incluidos errores en secuencias críticas para expresar el gen terapéutico. Los investigadores publicaron sus hallazgos en el servidor de preimpresión bioRxiv el mes pasado antes de la revisión por pares.1.
El estudio arroja luz sobre una «falta de conocimiento» sobre cómo realizar un control de calidad adecuado de los plásmidos en el laboratorio, dice el genetista Hiroyuki Nakai de la Universidad de Ciencias y Salud de Oregón en Portland, que no participó en el trabajo. Ya era consciente de los problemas que planteaban los plásmidos fabricados en laboratorio, pero le sorprendió la frecuencia de los errores revelados por el estudio. Se han publicado muchos artículos científicos en los que los resultados no pueden reproducirse debido a errores en el diseño del plásmido, añade.
Se perdió el tiempo
Los plásmidos son herramientas populares en los laboratorios de biología porque son un organismo modelo ampliamente utilizado, incluidas las bacterias. Escherichia coli, utilizan construcciones para almacenar e intercambiar genes. Esto significa que los biólogos pueden crear plásmidos de diseño que contengan diferentes genes de interés y luego combinarlos. E. coli Tómalos y haz muchas copias.
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Bruce Lahn, científico jefe de VectorBuilder, con sede en Chicago, Illinois, una empresa que proporciona herramientas de entrega de genes, dice que él y otros biólogos han estado notando problemas con la calidad de los plásmidos durante años. Por ejemplo, cuando Lahn era profesor en la Universidad de Chicago, un estudiante de posgrado pasó seis meses en su laboratorio intentando reproducir dos plásmidos que habían aparecido en la literatura científica. «No pensamos dos veces en la calidad de los plásmidos, pero el experimento no funcionó» porque los plásmidos contenían errores, afirma.
Ahora en VectorBuilder, Lahn dice que se encuentra con el problema todo el tiempo, por lo que decidió evaluarlo sistemáticamente. Cuando los clientes envían plásmidos defectuosos, «se pierde mucho tiempo», y los pasos adicionales involucrados en el control de calidad aumentan el costo de producir los plásmidos y empaquetarlos como virus, dice.
El análisis del equipo de VectorBuilder encontró una mezcolanza de errores entre los más de 2500 plásmidos que evaluó. Algunos contienen genes que codifican proteínas tóxicas. E. coli, lo que significa que los biólogos pueden retardar o detener el crecimiento de organismos que dependen de sus plásmidos para replicarse. Otros, destinados a empaquetarse en virus, codifican proteínas que son tóxicas para esos virus. Y algunos contienen secuencias de ADN repetitivas que almacenan mutaciones dentro de los plásmidos.
Comprobando errores
Los defectos más extendidos descubiertos por Lahn y sus colegas estaban relacionados con una importante herramienta de terapia genética. Las terapias suelen estar empaquetadas en virus adenoasociados (AAV), que en su mayoría son inofensivos y pueden transportar las terapias al interior de las células. Al producir plásmidos para estos AAV, los investigadores intercalan el gen terapéutico entre secuencias conocidas como ITR, que desempeñan un papel fundamental a la hora de garantizar que el gen se empaquete en el virus para su administración. Básicamente, estas secuencias envían una señal biológica a las células que dice: «Pertenezco a este virus». Pero el equipo descubrió que alrededor del 40% de los plásmidos AAV en el estudio tenían mutaciones en las regiones ITR que apagaban este importante mensaje. Si los investigadores utilizan estos plásmidos mal diseñados, es posible que su terapia genética no funcione, y los científicos pueden tardar mucho en descubrir por qué.
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Mark Kay, especialista en pediatría y genética de la Facultad de Medicina de Stanford en California, también ha visto de primera mano que los errores en los plásmidos pueden retrasar los proyectos de laboratorio. Pero confía en que los científicos puedan identificar y corregir estos errores. Los investigadores de terapia génica están familiarizados con los posibles problemas de ITR y es poco probable que los errores causen problemas en entornos clínicos, afirman. Esto se debe a que las agencias reguladoras como la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. tienen estándares estrictos que requieren que los investigadores analicen cuidadosamente sus plásmidos antes de usarlos en la clínica.
Nakai dice que comprobar los plásmidos en busca de errores de secuenciación podría alertar a los investigadores sobre los problemas destacados en el estudio. Algunas empresas, incluidas Plasmidsaurus en Eugene, Oregón, y Elim Biopharmaceuticals en Hayward, California, ofrecen secuenciación de plásmidos por unos 15 dólares estadounidenses por muestra, dice Nakai, que no tiene ningún interés financiero en ninguna de las empresas. Recomiendan que los nuevos miembros del laboratorio dediquen tiempo a aprender de constructores de plásmidos experimentados; Es un proceso manual tedioso, pero si se hace mal, puede desperdiciar enormes cantidades de tiempo y dinero.
Otra forma que tienen los laboratorios de evitar problemas es compartir públicamente sus secuencias de plásmidos en repositorios de acceso abierto, dice Melina Fan, directora científica de Adgen, una organización sin fines de lucro en Watertown, Massachusetts. Addgen proporciona uno de esos repositorios, dice Fan, y «secuencia los plásmidos depositados y comparte los datos de la secuencia a través de su sitio web para uso comunitario». La verificación de los plásmidos es importante, añade.
Lawn espera que el análisis de su equipo atraiga la atención de los investigadores sobre el hecho de que estas herramientas de laboratorio a menudo se dan por sentado. «La salud del equipo no es algo que la gente cuestione», afirma.
