La anatomía funcional de los bigotes de trompa de elefante

Especímenes de elefantes y ratas

Todos los especímenes utilizados en este estudio procedían de elefantes de zoológico y fueron recolectados por el IZW (Leibniz Institute for Zoo and Wildlife Research, Berlin) durante las últimas tres décadas de acuerdo con CITES (Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres) reglamentos Los informes de especímenes y la documentación CITES para todos los animales incluidos se conservan en el IZW. Todos los animales incluidos en el estudio murieron por causas naturales o fueron sacrificados por veterinarios de zoológico experimentados por razones humanitarias, debido a complicaciones de salud graves. La tabla 1 ofrece una descripción general de los especímenes de elefantes asiáticos. (Elephas máximo) y elefantes africanos (Loxodonta africana)junto con la edad y el recuento de bigotes en la punta del tronco derivados de estos animales.

Recolectamos bigotes de rata y FSC post-mortem de ratas long-evans macho de 6 semanas de edad sacrificadas bajo un permiso aprobado por el comité de la Oficina Estatal de Salud y Asuntos Sociales (LAGeSo) en Berlín (Número de licencia de animales: G0095-21 / 1.2 ).

Fotografía, conteo de bigotes y mediciones de grosor de bigotes

Fotografiamos las puntas del baúl desde todos los lados usando una cámara Sony α 7 R III con un objetivo Sony FE 90 Mm/2.8 Macro G OSS. La mayoría de las puntas de los troncos fotografiadas y analizadas se fijaron en una solución de formaldehído al 4 % o se congelaron a -20 °C; una minoría de las muestras consistía en material post-mortem fresco. Para contar los bigotes, ajustamos las curvas de color de las fotografías en Adobe Photoshop (Adobe Systems Incorporated) para lograr la máxima visibilidad de los bigotes. El conteo se realizó manualmente utilizando la herramienta multipunto en ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA). Para cada espécimen, contamos los bigotes en la punta y en aproximadamente ocho segmentos (pliegues cutáneos) proximales a la punta del tronco debido a la disponibilidad limitada de muestras de tronco completo. El primer autor (ND) obtuvo recuentos de bigotes de seis elefantes africanos y siete elefantes asiáticos usando cinco fotografías de cada muestra tomadas desde diferentes ángulos. Para dos puntas de tronco, un coautor (BG) contó los números de bigotes y obtuvimos números similares (una desviación de -5% y +11%); Todos los recuentos informados son los recuentos del primer autor. Los detalles sobre la especie y la edad de cada espécimen se proporcionan en la Tabla 1. Para un elefante africano, el recuento de bigotes se extrapoló debido a una muestra incompleta. Además, obtuvimos recuentos de bigotes de todo el tronco de un elefante asiático recién nacido (Hoa’s Baby) y un elefante africano recién nacido (AM1). Para dos adultos de cada especie (norte= 4; Ilona, ​​​​Unknown Asian, Linda y Zimba, consulte la Tabla 1), medimos el grosor de los bigotes usando ImageJ de las mismas imágenes que se tomaron para el conteo de bigotes. Las medidas se tomaron en el punto más ancho de cada bigote, justo donde sobresale de la superficie de la piel. Para cada espécimen, medimos el grosor de diez bigotes en cada una de cuatro áreas diferentes: la punta del tronco, el lado dorsal del tronco, el lado ventral del tronco y ambos lados del tronco. Nuestras observaciones sobre la longitud de los bigotes y la abrasión se realizaron a partir de imágenes de las muestras del tronco (norte= 6 elefantes africanos y norte= 9 elefantes asiáticos) y norte= 3 elefantes asiáticos de zoológico durante el manejo de rutina (ver más abajo).

Procedimientos experimentales con elefantes de zoológico

Se realizaron experimentos de comportamiento con elefantes asiáticos en el Jardín Zoológico de Berlín. Nuestros procedimientos experimentales fueron evaluados por el gobierno regional, que dictaminó que no se requiere un permiso formal de experimentación con animales dada la naturaleza no invasiva de nuestros procedimientos (LAGeSo StN-declaración 19.07.2021). Observamos varios elefantes asiáticos (norte= 5) durante el manejo de rutina y agarre controlado hápticamente en el elefante asiático hembra Anchali de 10 años. Anchali fue entrenado para recuperar fruta de una caja cerrada con un agujero para el tronco (ver Fig. 6), un entorno de comportamiento que requería localizar y agarrar o aspirar varias frutas (zanahorias, peras, plátanos, manzanas) bajo control táctil y olfativo. . . También obtuvimos información ad hoc sobre los hábitos de los elefantes (trompa izquierda frente a derecha) de los cuidadores de los animales.

Videografía y seguimiento de bigotes

La videografía de los bigotes de los elefantes fue un desafío porque los bigotes son delgados, los elefantes mueven sus trompas muy rápido y necesitábamos mantener una distancia de los animales por razones de seguridad (a pesar de que los elefantes con los que trabajamos estaban bien habituados a los humanos). El mejor metraje de los bigotes del tronco y la punta del tronco se obtuvo con el elefante Anchali en la tarea de recuperación de cajas de frutas descrita anteriormente. En otras circunstancias, resolver los bigotes del tronco era difícil o imposible y tales dificultades también limitaron nuestro estudio de los bigotes ventrales del tronco.

Obtuvimos videos de los experimentos de comportamiento descritos usando una cámara Sony α 7 R III con un objetivo Sony FE 16-35 mm F2.8 GM E-Mount. La velocidad de fotogramas se estableció en 100 Hz. Para el seguimiento de bigotes individuales, importamos videoclips de eventos individuales de recuperación de frutas (norte= 3) de la caja en ImageJ y los analizó manualmente siguiendo la base y la punta de los bigotes individuales (norte= 5, de ambos lados del tronco) en un intervalo de 1 s usando la herramienta de conteo múltiple. Exportamos las coordenadas de la base y la punta y trazamos las trayectorias y el ángulo entre el bigote y la vertical usando el paquete Matplotlib de Python. Calculamos el ángulo utilizando la siguiente fórmula, siendo Δx y Δy la diferencia entre las coordenadas cartesianas x e y de la base y la punta para cada punto de tiempo, respectivamente.

Identificamos el inicio de la succión para aspirar manzanas usando la pista de audio del video.

Fijación, seccionamiento y tinción con hematoxilina-eosina

Los troncos enteros o las puntas de los troncos se fijaron en formaldehído al 4% durante varios meses. Algunas de las muestras se congelaron y descongelaron antes de la fijación. Disecccionamos complejos de folículos sinusales (FSC) del tejido circundante o cortamos pequeños cubos de tejido que contenían uno o varios FSC. Para el corte criogénico, el tejido se transfirió a una solución de sacarosa al 30 % en tampón fosfato y se dejó durante al menos 24 horas antes del corte para la crioprotección. A continuación, incrustamos el tejido en un medio de congelación de tejidos (Leica Biosystems, número de catálogo 14020108926) y lo cortamos en secciones de 40 µm, ya sea perpendiculares o paralelas a la superficie de la piel, utilizando un micrótomo de congelación. Para la tinción con hematoxilina-eosina, las secciones se montaron y secaron durante al menos 24 h, seguidas directamente de la tinción con solución de hematoxilina-eosina. Las imágenes de las tinciones de hematoxilina-eosina se adquirieron con una cámara MBFCX9000 (MBF Bioscience, Williston, EE. UU.) en un microscopio Olympus BX51 (Olympus, Japón) utilizando el software Neurolucida (MBF Bioscience, Williston, ND). Describimos las estructuras características y la anatomía general del FSC utilizando secciones teñidas con hematoxilina-eosina. norte= 8 folículos (de Hoa’s Baby, Burma, Unknown Asian y Zimba, ver Tabla 1).

Inmunohistoquímica/caracterización de anticuerpos

Incubamos las secciones en un bloqueador de PBS 0,1 M, pH 7,2, con Triton X-100 al 0,75 % y albúmina de suero bovino (BSA) al 2,5 % durante una hora a temperatura ambiente antes de incubarlas con un anticuerpo policlonal contra Neurofilament-Heavy (NF-H) (1:1000, Millipore, número de catálogo AB5539) en PBS 0,1 M, pH 7,2, con Triton X-100 al 0,3 % y BSA al 1 % durante 48 h a 4 °C. Luego lavamos e incubamos las secciones en una solución de bloqueo que contenía BSA al 1 % en PBS 0,1 M y anticuerpo secundario IgY anti-pollo de cabra conjugado con Alexa Fluor 488 (1:1000, Invitrogen, número de catálogo A-11039) a 4 °C. . durante la noche. Al día siguiente, lavamos, montamos y cubrimos las secciones con un medio de montaje (Fluoromount G, SouthernBiotech, Catálogo Nr. 0100-01). Tomamos micrografías de los portaobjetos utilizando un microscopio de epifluorescencia Leica DM5500B (Wetzlar, Alemania). Teñimos secciones de norte= 17 folículos de tres muestras diferentes de elefantes (Hoa’s Baby, Burma y Zimba, consulte la Tabla 1) usando inmunohistoquímica. Para comprender mejor la importancia relativa de los bigotes del tronco como estructuras sensoriales, contamos el número de axones por FSC (norte= 9, FSC de Hoa’s Baby) utilizando secciones transversales en serie en ImageJ.

Tinción con yodo y tomografía microcomputarizada (microCT)

Tomamos todas las muestras utilizadas para la exploración por microCT de muestras de troncos que se fijaron en formaldehído al 4 % durante varios meses. Para caracterizar los folículos de diferentes regiones del tronco, cortamos la trompa de un elefante asiático recién nacido (Hoa’s Baby, consulte la Tabla 1) por la mitad sagital y la tiñemos con una solución de yodo al 1 % durante 33 días para mejorar el contraste del tejido. Para caracterizar las FSC ventrales, cortamos una pequeña pieza (2 cm × 1,5 cm × 1 cm) de la misma trompa de elefante asiático bebé y la tiñemos con una solución de yodo al 1 %, seguida de una solución de yodo al 2 % durante 4 días cada una. También diseccionamos FSC individuales (norte= 4, de Birmania, Zimba y Linda, consulte la Tabla 1) de piezas de tronco de diferentes muestras de punta de tronco y las tiñeron en solución de yodo al 1% durante 48 h antes de escanear. Escaneamos FSC individuales incrustándolos en una mezcla de gelatina al 2,5 % y agarosa al 1 % para evitar que la muestra se mueva en el escáner y minimizar el sangrado de yodo. Para la comparación de la estructura y el tamaño, diseccionamos el folículo de un folículo de bigote δ de rata de una almohadilla de bigote facial, que se fijó en formaldehído al 4% durante> 20 días. El folículo se tiñó en solución de yodo al 1% durante 24 h.

Para comparar el grosor y la forma de los bigotes, extrajimos del folículo los bigotes laterales del tronco de un elefante asiático y africano adultos (Birmania y Zimba, consulte la Tabla 1) y un bigote δ de rata y los escaneamos incrustados en agarosa al 2 % después de la tinción. .los en solución de yodo al 1% durante 10 min. Todas las soluciones de yodo se prepararon por dilución de yodo de Lugol al 5% en agua destilada. Realizamos las exploraciones utilizando un escáner YXLON FF20 CT (YXLON International GmbH, Hamburgo, Alemania) de nuestro instituto. Los escaneos de la trompa de elefante recién nacido se realizaron con un voltaje de fuente de 115–120 kV, una corriente de fuente de 20–25 μA y una exposición de 1000 ms. Las exploraciones de los FSC se realizaron a 36–55 kV, 81–120 µA y 2000 ms de exposición. Se escanearon bigotes individuales a 50 kV, 81 µA y 333 ms.

Estadísticas y reproducibilidad

Si no se indica lo contrario, todos los errores se refieren a la desviación estándar.

Probamos la normalidad utilizando las pruebas de Shapiro-Wilks. Las pruebas de Levene se usaron para probar la igualdad de varianzas entre las poblaciones. Si las poblaciones tenían varianzas iguales, probamos la diferencia entre las medias de la población usando un estudiante t-prueba, de lo contrario, usamos la de Welch t-prueba. Todo tLas pruebas fueron bilaterales y se rechazó la hipótesis nula cuando pag<0,05. Probamos la importancia de las diferencias en la media de más de dos poblaciones utilizando un ANOVA de una vía. Las pruebas post-hoc para la comparación por pares de grupos se realizaron utilizando una prueba de Scheffé si las poblaciones mostraban varianzas iguales; de lo contrario, se utilizó una prueba de Tukey para las pruebas post-hoc. Determinamos las diferencias en la lateralidad de la longitud del bigote entre elefantes recién nacidos y adultos utilizando la prueba exacta de Fisher, con datos de ambas especies de elefantes combinados.

El análisis estadístico se realizó utilizando los paquetes Pythons Numpy, Scipy y Scikit-posthocs. Usamos Numpy para calcular las medias y las desviaciones estándar, Scipy para t-pruebas, el ANOVA, las pruebas de Shapiro-Wilks y las pruebas de Levene y funciones del paquete Scikit-posthoc para pruebas post-hoc.

Aclaramos los tamaños de muestra de los experimentos realizados en las respectivas secciones de métodos.

Segmentación y análisis de tomografía computarizada

Para la segmentación de las FSC de bigotes troncales utilizamos una versión extendida del software Amira (AmiraZIBEdition 2021, Zuse Institute). Para eso, marcamos el área del folículo en cada décima diapositiva y se extrapoló el volumen entre dos áreas marcadas. Obtuvimos las longitudes de los folículos utilizando la función Longitud3D del módulo de análisis de etiquetas de Amira. En total, se segmentaron 43 FSC de Hoa’s Baby, norte= 9 en la región de la punta, norte= 8 FSC laterales y norte= 26 FSC ventrales.

Dibujos

Esquemas en las Figs. 1e, f y 6b fueron dibujados por ND usando imágenes de referencia tomadas por los autores (ND y LVK). La figura 6a fue dibujada por LVK a partir de imágenes de video del experimento. Los contornos en la Fig. 2f fueron dibujados por ND usando la Fig. 1a, b de Maier & Brecht (2018)²⁰ como una referencia. Los gráficos de puntos y los mapas de densidad de las Figs. 1e, f y 2f se realizaron utilizando la biblioteca Matplotlib de Python.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.