quimicos
El agua (grado HPLC y ULC/MS), etanol, acetonitrilo (ACN), ácido trifluoroacético (TFA) y xileno se obtuvieron de Biosolve BV (Valkenswaard, Países Bajos). (mathrm{alfa})-El ácido ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), el anhídrido citracónico y el sulfato de potasio se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MI, EE. UU.). El ácido clorhídrico fumante al 37 % se obtuvo de Supelco (Bellefonte, PA, EE. UU.). El kit básico de formación de imágenes de N-glicanos se obtuvo de GlycoPath Inc. (Charleston, Carolina del Sur, EE. UU.).
Muestras
Las muestras de pacientes (n = 2) se obtuvieron en el marco de programas prospectivos de biobancos locales que se iniciaron en 2017 (Maastricht) y 2009 (Aquisgrán). Para MSI, el flujo de trabajo para la crioconservación de tejidos se optimizó para minimizar el tiempo entre la escisión quirúrgica y el procesamiento de diagnóstico de las muestras por parte del patólogo. Los programas de biobancos fueron aprobados por los comités éticos locales (Maastricht #16-4-153, Aachen EK 206/09), y todos los pacientes programados para tratamiento quirúrgico de tumores hepatobiliares fueron elegibles para participar. Los pacientes participantes dieron su consentimiento informado por escrito para el almacenamiento y uso en investigación de sus muestras.
El estudio sobre la muestra de TMA (n = 1) fue aprobado por la junta de revisión de ética institucional (Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Técnica de Munich, Número de Protocolo 403/17S). Todos los experimentos que utilizaron muestras de pacientes humanos se realizaron de conformidad con las directrices institucionales respectivas.
Se obtuvieron muestras de riñón de ratón fresco congelado (n = 1), bazo (n = 2) y cerebro (n = 1) de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación ética adecuada (2014-108 en GROW Maastricht University y A3272-01 en Johns Hopkins University) y de conformidad con las pautas institucionales respectivas.
preparación de la muestra
La micromatriz de tejido FFPE (TMA) de colangiocarcinoma (CCA) y adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) se seccionó a 5 µm de espesor y se montó en Intellislides (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Alemania). Los tejidos frescos congelados se seccionaron a 12 µm de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) (Delta Technologies Ltd, Loveland, CO, EE. UU.). Todas las muestras congeladas frescas se midieron por duplicado o más.
Para el tejido FFPE, se utilizó el protocolo provisto con los kits de imágenes GlycoPath Basic N-Glycan (GlycoPath Inc., Charleston, SC, EE. UU.).5. Brevemente, las secciones de TMA se desparafinaron en el horno calentando a 60 °C durante 60 min. Después del desparafinado, los pasos de lavado consistieron en 2 veces durante 3 min en xileno, 2 veces durante 1 min en etanol al 100 %, 1 vez durante 1 min en etanol al 95 %, 1 vez durante 1 min en etanol al 70 % y 2 veces en agua destilada durante 3 min. Posteriormente, la recuperación del antígeno se realizó en un tampón de anhídrido citracónico a pH = 3. Los portaobjetos se enfriaron y secaron en un desecador, seguido de una aplicación de PNGasa F con un pulverizador HTX M3+ (HTX Technologies LLC, Carrboro, EE. UU.). A continuación, los portaobjetos se incubaron durante 2 horas a 37,5 °C. Finalmente se aplicó la matriz CHCA según protocolo GlycoPath con el atomizador HTX M3+5.
Para tejido fresco congelado, el protocolo desarrollado comienza con los pasos de lavado y fijación. El portaobjetos con las secciones de tejido se sumergió 2 veces durante 2 min en etanol al 100 % enfriado con hielo, 1 vez durante 1 min en etanol al 96 % enfriado con hielo, 1 vez durante 1 min en etanol al 70 % enfriado con hielo y 2 veces para 2 min en agua de grado HPLC enfriada con hielo. Posteriormente, los portaobjetos se secaron en un desecador y los puntos didácticos se aplicaron con un marcador de pintura blanca. Los portaobjetos se escanearon antes de la recuperación del antígeno. La recuperación del antígeno se realizó con el Retriever 2100 (Aptum Biologics Ltd, Rownhams, Reino Unido) durante 20 min a 121 °C. El tampón de anhídrido citracónico (pH = 3) se preparó según lo descrito por Drake et al.5 y en el protocolo GlycoPath. Se sacó el portaobjetos del recuperador de antígenos y se enfrió en un baño de hielo durante 5 min. Luego, la mitad del tampón se reemplazó con agua de grado HPLC y el portaobjetos se volvió a colocar para enfriar más en un baño de hielo. Esto se repitió dos veces más, después de lo cual los portaobjetos se enjuagaron con agua de grado HPLC y se secaron en un desecador. PNGase F se preparó recientemente antes de la aplicación de la enzima con el rociador HTX M3+ utilizando los siguientes ajustes: temperatura = 45 °C, velocidad de la boquilla = 1200 mm/min, caudal = 30 µL/min, concentración de PNGase F = 0,1 µg/µL, número de pasadas = 8, espacio entre pistas = 2,5 mm y presión de gas nitrógeno de 10 psi. La cámara de incubación se preparó colocando toallitas de papel empapadas con solución saturada de sulfato de potasio en el fondo de una placa de Petri de vidrio con dos toallitas adicionales enrolladas en una estructura de soporte que mantuvo los portaobjetos alejados del fondo empapado de la cámara de incubación. Además, se agregaron 5 g de sulfato de potasio sólido en la parte superior de las toallitas dentro de la cámara de incubación. La cámara de incubación se precalentó en el horno a 37,5 °C durante 30 min antes de colocar los portaobjetos en la cámara de incubación. Los portaobjetos se transfirieron a una cámara de incubación tan pronto como se realizó la aplicación de la enzima y se dejaron incubar durante la noche (16 h). Luego, los portaobjetos se colocaron en un desecador para que se secaran antes de la aplicación de la matriz. La matriz CHCA se aplicó con el rociador HTX M3+ (HTX Technologies LLC, Carrboro, EE. UU.) con los siguientes ajustes: temperatura = 75 °C, velocidad de la boquilla = 1200 mm/min, caudal = 120 µL/min, concentración de CHCA = 10 µg /µL, número de pases = 4, espacio entre pistas = 1,5 mm y presión de gas nitrógeno de 10 psi.
Experimentos MALDI MSI
Los datos MALDI-MSI del conjunto de datos de tejido FFPE se adquirieron en un timsTOF fleX en polaridad positiva (Bruker Daltonik GmbH, Alemania) con un tamaño de píxel de 20 × 20 µm, utilizando 300 disparos y una frecuencia láser de 10 kHz. Los datos MALDI-MSI del conjunto de datos de tejido fresco congelado también se adquirieron con la misma polaridad, número de disparos láser y frecuencia láser, pero con un tamaño de píxel de 16 × 16 µm. El instrumento está equipado con un láser Nd:YAG que emite a 355 nm con un diámetro de foco láser de 5 µm. La calibración de masa se realizó utilizando fósforo rojo antes de los experimentos de formación de imágenes.
Análisis de los datos
La mayoría del análisis de datos se realizó con SCiLS lab 2022a (SCiLS GmbH, Bremen, Alemania). Todas las imágenes generadas se normalizaron con TIC y se exportaron desde el laboratorio SCiLS. Los espectros promedio de los experimentos FFPE y FF, MALDI MSI se exportaron del laboratorio SCiLS y se importaron en mMass donde se realizó la selección de picos15. Los ajustes utilizados para la captación de picos en mMass fueron los siguientes: umbral S/N de 5, umbral de intensidad relativa de 0,5 %, altura de captación establecida en 75 y se aplicaron funciones de línea de base y eliminación de isótopos.
Identificación de glicanos
Todas las identificaciones se realizaron tentativamente en base a una masa precisa y datos de la base de datos GlycoPath generada con mediciones MALDI FT-ICR. El acceso a la base de datos se proporciona con la compra del kit básico de imágenes de N-glicano.
Aprobación ética
Los comités éticos locales aprobaron los programas de biobancos (Maastricht #16-4-153, Aachen EK 206/09), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales cuyos materiales se analizaron en el estudio.
declaración de consentimiento informado
Se renunció al consentimiento del paciente debido al uso de datos de archivo de naturaleza anónima que no revelan las identidades de los pacientes. Se puede renunciar al consentimiento del paciente, tal y como contempla la ley estatal bávara (disponible solo en alemán), en la sección de la Ley de hospitales bávaros (BayKrG), publicada el 28 de marzo de 2007 (https://www.gesetze-bayern.de /Content/Document/BayKrG/true, consultado el 28 de octubre de 2021), sobre el artículo 27 de Protección de Datos, Sección 4.
Declaración de la junta de revisión institucional
El estudio fue aprobado por la junta de revisión de ética institucional (Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Técnica de Munich, Protocolo Número 403/17S).
